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实时荧光定量PCR技术及应用

信息来源:本站  浏览次数:1215  发布时间:2014-11-24

1概述

荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合,而探针是整个荧光定量PCR反应的核心。其主要功能是对未知模板进行定量分析,确定病毒含量。实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规的PCR相比,具有灵敏性高、特异性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。目前已在基因工程,分子生物学研究,畜牧兽医等领域得以广泛应用

2荧光定量PCR技术的原理

荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,这些荧光物质有其特定的波长,利用荧光定量PCR仪自动监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于PCR并非一直呈指数扩增,使得PCR扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量,因此荧光定量PCR引入一个概念,即循环阈值(cycle threshold value,Ct)。其含义是在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。经数学理论证明,Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式,使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。

2.1荧光定量PCR技术的两种定量形式

荧光定量PCR标准品选择很重要,尽量选择与实际检测样品结构近似的样品,通常采用重组质粒或PCR扩增产物作为标准品来实现绝对定量。一般情况下,以重组质粒为标准品较常见,通常将PCR产物克隆到载体上,然后抽提出质粒,经分光光度计测量浓度,计算出拷贝数,并进行梯度稀释。绝对定量也具有相应的不足,标准品的稳定性很难得到保证,标准品长时间保存可能会降解,致使浓度下降,单位体积的拷贝数不准确,影响定量PCR的结果,导致绝对定量失去意义。

相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素,通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA。相对定量包括三种方法:(1)双标准曲线法,目的基因、管家基因分别作标准曲线,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。(2)2-△△Ct法,当目的基因和管家基因的扩增效率相等,这时就不需要作标准曲线,而是通过比较△Ct值来确定目的基因的表达量。(3)动力学法,在PCR反应中,即使相同的基因,扩增效率也不可能为1,此方法就很好地反映了每次循环的扩增效率,更接近于实际反应,但由于动力学法涉及到许多数学公式,计算较复杂,未能得到广泛的运用。

在应用荧光定量PCR技术中,无论是绝对定量还是相对定量仍存在问题有侍解决。在标准曲线定量中,标准品的制备是一个必不可少的过程。目前没有统一标准,各个实验室所用的绘制标准曲线的样品各不相同,致使实验结果缺乏可比性。另外,由于定量PCR在仪器中自动生成结果,没有电泳检测的过程,因此无法判断扩增片段的大小。此外,荧光定量PCR技术实验成本比较高,从而也限制了其广泛的应用。

2.2 荧光定量PCR技术的种类

实时荧光定量PCR技术的常用的方法包括荧光染料法和探针法。

非特异性DNA结合染料法是在常规PCR反应体系中加入了染料分子,反应进行时染料与DNA双链结合,结合后在激发光源的照射下发出荧光信号,没结合不会被激发出任何荧光信号,其信号强度代表双链DNA分子的数量。随着PCR产物的增加,结合量也增加,同时荧光信号也在增大。染料分子除了与特异性的靶序列扩增产物结合外,还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合,从而造成扩增效率的降低、特异性差。所以该方法对引物设计和试验环境要去很高。为了分辨非特异性结合,运用溶解曲线的分析数据是很好的方法。目前应用最广泛的染料是SYBR Green I。

探针法主要是利用了具有5′~3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶,并加入了具有序列特异性的荧光探针。该方法主要特点是模板不但与引物结合,还要与序列特异性的荧光探针结合,从而提高了检测的特异性。与染料法相比不用绘制溶解曲线,特性性强,试验结果更为可靠。目前市场上的探针主要种类有:TaqMan、Molecular Beacon、hybridization probe等,其中以TaqMan探针应用最广泛,但探针标记成本较高,不便普及应用

3荧光定量PCR技术在动物医学领域中的应用

随着荧光定量PCR技术的成熟和发展,对许多难培养或不能培养的动物传染病病原用荧光定量PCR技术进行诊断就简单易行。该技术还进一步的弥补了一般技术对疾病亚临床或潜伏感染的诊断无能为力的缺点,并且解决了许多烈性传染病对人和动物造成危害的问题,使疾病病原检测变的更加安全。目前国内外已建立了许多用于病原体检测的荧光定量PCR方法。Takele等建立了定量检测来源于猪的PERV的TaqMan技术。荧光定量PCR技术对于结核分枝杆菌的检测在国内应用的比较广泛,许多家公司已研发出用于定量检测的试剂盒,并推向了市场。Bumstead等(1997)用荧光定量PCR检测到鸡马立克氏病病毒存在,而且可准确定量。陈玉栋等(2003)首次建立了用于检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR方法,解决了猪瘟疫苗株和野毒株很难区分的难题。宋志军等(2006)建立了猪PRRSV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,具有很高的敏敏性,并在2009年王秋泉根据目前流行的高致病性PRRSV Nsp2基因片段的特征变化设计了一对引物和探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量PCR方法。另外,荧光定量PCR技术还应用其他重要动物传染病的诊断,例如,鸡新城疫、禽流感、鸭乙型肝炎、伪狂犬病和口蹄疫等。总之,该技术为兽医领域的病原诊断研究提供了重要的方法。



此外,荧光定量PCR技术在其他方面也得到了广泛的应用,如寄生虫的检测和鉴别、细胞因子表达定量检测、环境监测、动物检疫和转基因的研究等。随着分子生物学的发展,以及试验人员在实践中经验的积累,会使荧光定量PCR技术得到进一步完善。http://www.swzp.com/zdcp2.html